Cultura in vitro de embriões de orquídeas na Amazônia brasileira

Recebi do amigo Dr. Pedro Ivo Soares Braga, professor titular da UFAM, um artigo muito interessante de sua autoria, sobre cultura in vitro de orquídeas na Amazônia brasileira, onde descreve como se trabalhar com cápsula ainda verde em determinado meio de cultura. Apresenta algumas vantagens, principalmente em relação ao tempo de crescimento e floração. Vejam como esta cultura in vitro funciona:

Introdução -
As orquídeas apresentam um desenvolvimento vegetativo lento, visto que, a divisão de uma muda leva, no mínimo, oito anos, o que torna a multiplicação de grandes quantidades de plantas para comercialização, muita lenta e onerosa.
A descoberta da germinação de sementes somente com a infecção de fungos micorrízicos, chamado método simbiótico, praticada por cultivadores foi amplamente utilizada por longos anos.
A descoberta de Knudson de que sementes de orquídeas poderiam germinar em um meio relativamente simples, contendo açúcar e sais minerais, mostrou-se fundamental para dar início ao chamado método assimbiótico de germinação de orquídeas, atualmente extensamente empregado.
São três as técnicas atualmente utilizadas: cultura assimbiótica ou semeadura em vidro; cultura de tecido vegetal ou meristemática e cultura de embriões imaturos, discutida nesse artigo.
A cultura assimbiótica ou semeadura in vitro, de orquídeas, constitui uma técnica bastante relevante do ponto de vista comercial e também ecológico.
As plantas produzidas dessa forma são altamente interessantes para programas de reintrodução de espécies nativas, em áreas de preservação ambiental, ou naquelas que foram impactadas.
A propagação comercial de orquídeas de formas idênticas via cultura de tecidos vegetais é uma realidade. Várias são as vantagens. As espécies com flores vistosas são muito procuradas por colecionadores e cultivadores e, portanto, vulneráveis à extinção na natureza. Através dessa técnica pode-se, em pouco tempo, produzir-se milhares de plantas a partir de meristemas como gemas e extremidades de raízes.
No caso da cultura de embriões imaturos, a vantagem é a redução do tempo de produção de plântulas. Adicionalmente tem-se a possibilidade de se obter a variabilidade genética, necessária para programas de recomposição e manejo de áreas degradadas. Ao mesmo tempo podem-se fornecer mudas para a floricultura.
A propagação vegetativa in vitro, também denominada de micropropagação por causa do tamanho dos propágulos utilizados, é a aplicação mais prática da cultura de tecidos e aquela de maior impacto.
As orquídeas podem ser propagadas por cultura in vitro a partir das sementes, por gemas de brotos vegetativos e pontas de raízes.
A maioria das plantas adultas de orquídeas na Amazônia brasileira abriga fungos endofíticos, o que geralmente inviabiliza a reprodução dessas por meio de micropropagação, uma vez que o fungo além de desenvolver-se internamente no meio pode matar o explante ou também alterar os resultados do meio utilizado.

Cultura in vitro de embriões de orquídeas.
Também conhecida por cultura de sementes imaturas. Consiste basicamente em se desenvolver sob condições assépticas os embriões obtidos de uma cápsula ainda verde em meio de cultura apropriado.
Os benefícios dessa técnica trazem considerável redução no tempo para utilização das sementes, pois, em muitas espécies de interesse comercial, o fruto de algumas espécies apresenta um período de desenvolvimento superior a seis meses, alcançando em alguns casos, mais de um ano.
Nesse caso a utilização precoce das sementes ainda imaturas possibilita a obtenção de plântulas em um menor período de tempo. Por outro lado é importante ressaltar que, naqueles casos, onde o período de maturação dos frutos é longo, a planta pode ter o seu desenvolvimento afetado, podendo até levá-la a morte. As condições especiais de cultura in vitro proporcionam o desenvolvimento normal do embrião imaturo.
Na obtenção de orquídeas, por exemplo, com a cultura de embriões iniciada 60 a 90 dias após a polinização, as plântulas podem ser produzidas em curto espaço de tempo, enquanto normalmente a maturação dos frutos requer cerca de 12 meses. Seria oportuno considerar também, que os embriões prescindem de esterilização química, o que geralmente não ocorre com as sementes maduras, as quais muitas vezes são perdidas devido a uma sub ou sobre esterilização.
Por outro lado, esta técnica traz a vantagem de não se retirar gemas da planta mãe, o que poderia prejudicar o seu desenvolvimento e levá-la à morte.
As plântulas a serem produzidas por essa técnica, acompanhadas dos meios de culturas, são colocadas em frascos de vidro, com tampa de diversos materiais como: baquelite, metálica, borracha e plástico, que aguentam ser autoclavados a altas temperaturas,
Meios de cultura - o sucesso no estabelecimento da cultura de células, órgãos ou tecidos in vitro dependem, em geral, da seleção do explante, das condições de temperatura e luminosidade em que é mantida e de um meio de cultura conveniente.
O meio de cultura consiste de componentes essenciais e opcionais.
Os essenciais compreendem a água, os sais inorgânicos, a fonte de carbono e energia, vitaminas e substâncias reguladoras de crescimento.
Os outros componentes, que podem ser importantes, incluem aminoácidos e amidas, ácidos orgânicos e substâncias naturais complexas.
Uma contribuição significativa para a formulação de um meio de crescimento definido, adequado para uma ampla série de aplicações, foi feita por Murashige & Skoog (1962), onde aperfeiçoaram os tipos existentes de meios para cultura de tecidos de plantas, a tal ponto que, o seu meio (o meio MS) se tornou uns dos mais amplamente utilizados em trabalhos de cultura de tecidos, uma vez que suas diluições e modificações têm apresentado resultados satisfatórios para diversas espécies.
Os meios nutritivos podem ser sólidos ou líquidos, sendo que cultura em meio líquido normalmente exige algum tipo de suporte ou agitação para fornecer o oxigênio necessário para a respiração do explante e para retirar a polaridade de crescimento das células, e os meios semi-sólidos ou sólidos, tradicionalmente são solidificados com Agar, um polissacarídeo extraído de algas marinhas.
As plântulas podem crescer em muitos meios dependendo da espécie. Todos os meios de cultura designados para clonação de qualquer vegetal são constituídos, basicamente, por uma mistura de sais minerais (macro e micro nutrientes), como fonte de energia os carboidratos, reguladores de crescimento e extratos de plantas, tais como, polpa de banana, extrato de batata e o Agar.
A utilização do meio de cultura básico mais favorável para iniciar a cultura in vitro de orquídeas a partir de embriões é a fórmula C.
O cultivo de embriões em meio líquido acelera o desenvolvimento inicial dos embriões, quando comparado aos meios geleificados.
Após a fase inicial esses são transferidos para meios sólidos, para alcançar o desenvolvimento pleno da plântula.

Composição química do meio “MK” fórmula C. (Knudson, 1946).
COMPONENTES
CONCENTRAÇÃO (g/L)
Ca (NO3)2 4H2
1,00
KH2PO
0,250
MgSO4 –7H2
0,250
(NH4) 2SO2
0,500
FeSO2-Na2EDTA
0,024l
MnSO4-4H2
0,0075
Sacarose
20,00
Agar
12,00

Composição química do meio “MS” (Murashige & Skoog, 1962) e suas respectivas concentrações.
SAIS
SOLUÇÃO FINAL
MACRONUTRIENTES
P.M.
Mg/L
MM
1 - NH4NO3
80.04
1.649
20.6
2 - KNO3
101.11
1.901
18.8
3 - CaCl2 2H2O
147.02
441
3.0
4 - MgSO47H2O
246.50
370
1.5
5 - KH2PO4
136.09
170
1.25
6 - Na2 EDTA
372.25
37.25
30.23
7 - FeSO37H2O
278.03
27.80
0.1
MICRONUTRIENTES
P.M
Mg/L
MM
8 - H3Bo3
61.83
6.18
100
9 - MnSO4H2O
169.01
16.90
100
10 - ZnSO47H2O
287.93
8.63
30
11 - Na2MoO42H2O
241.93
0.242
1.0
12 - CoCl26H2O
237.93
0.0238
0.1
13 - CuSO45H2O
249.68
0.0250
0.1


SUPL. ORGÂNICOS
P.M
Mg/L
MM
14 - INOSITOL
180.20
99.11
550
15 - TIAMINA. HCL
337.27
10.11
30
16 - PIRIDOXINA.HCL
205.64
2.05
10
17 - ÁC. NICOTÍNICO
123.11
1.84
15
A fórmula C de Knudson adicionada de carvão ativado e banana é o mais apropriado para a germinação de sementes e culturas de “seedlings” de orquídeas tropicais epífitas.
A adição de (100 g/L) de polpa de banana madura ao meio de cultura semi-sólido após a transferência dos protocormos favorece a formação de plântulas completas.
A adição de polpa de banana ao meio pode apresentar um efeito positivo no crescimento de plântulas, entretanto não existem razões específicas que possam avaliar tal efeito.
Também é importante destacar que a escolha da variedade da banana e seu tempo de maturação podem afetar nos resultados esperados. Dessa forma a utilização da banana madura seria mais recomendada.
Sobre a utilização do carvão ativado, observou que o escurecimento do meio com carvão teve um efeito claramente positivo no crescimento de plântulas.
O carvão ativado pode ser autoclavado, embora o meio precise ser agitado após autoclavagem até a solidificação para que o mesmo permaneça em suspensão.
O carvão ativado tem duas funções: 1ª ele escurece o meio, impedindo a incidência da luz na base do explante, reduzindo a oxidação; 2ª adsorve os compostos tóxicos presentes no meio, ou os formados durante a oxidação dos compostos fenólicos.
Descontaminação das cápsulas, manipulação dos embriões e formação dos protocormos.
Toda essa operação deverá se feita numa sala de cultura, previamente esterilizada para evitar contaminações, sem vento encanado e, em uma câmara de fluxo laminar, também previamente esterilizada.
Esterilizar as cápsulas por meio de uma solução de água sanitária (comercial) a 20% com três gotas do umectante Tween (80), utilizado com a finalidade de homogeneizar a ação da solução descontaminante, onde ficaram imersas durante 20 minutos.
Decorrido o tempo, lavá-las em água, previamente, destilada e autoclavada, com a finalidade de evitar que as substâncias desinfetantes continuem atuando e provoquem contaminações.
Em seguida, colocá-las em placas de Petri e abri-las com auxílio de bisturi, expondo-se a massa esbranquiçada de embriões imaturos.
Pequenas porções de tamanho equivalente destes embriões serão retiradas e inoculadas, com auxílio de uma pinça, nos frascos com meio líquido (MK), descrito por Knudson fórmula C.
Utilizar tantos frascos quanto necessário, contendo 50ml de meio.
Os frascos inoculados serão mantidos numa estufa incubadora “Shaker”, com temperatura de 260 C com 50 rpm e 1000 LUX fornecidas por lâmpadas fluorescentes brancas frias (luz do dia), sob constante agitação durante 45 dias.

Transferência dos protocormos –
Após descartar o meio liquido onde se encontram os protocormos, fazer 3 lavagens por 5 minutos, com água destilada e autoclavada. A seguir colocá-los em placa de Petri contendo papel filtro para retirada do excesso de umidade. Em seguida, transferir-se 3-5 protocormos para os frascos com os respectivos meios de cultura.
Condições da cultura –
O pH dos meios de cultura deverá ser ajustado para 5,5 ± 0,1, utilizando-se NaOH ou HCl a 0,1 ou 0,5N.
A esterilização do meio bem como dos frascos a serem utilizados deverá ser realizada por autoclavagem à temperatura de 1210 C e à pressão de 1,05 kg/cm2 durante 15 minutos.
Após autoclavagem o meio deverá ficar em repouso em uma sala com condições apropriadas por 72 horas, para observar-se a eficiência da esterilização, no sentido de precaver-se contra contaminações e, conseqüentemente, perda de material.
Depois da transferência dos protocormos os frascos terão suas tampas lacradas com parafilme para auxiliar na proteção contra contaminações.
Os frascos com os protocormos serão mantidos em sala de crescimento, com as seguintes condições: temperatura de 26 + 1o C, fotoperíodo de 18 horas luz e intensidade luminosa de 2000 lux fornecidas por lâmpadas fluorescentes brancas frias (luz do dia).
Caso não ocorra nenhuma contaminação as plântulas depois de 9 meses estarão prontas para serem transplantadas, para pequenos vasos com fibra de coco e esfagno.
Para transplantar as plântulas colocar água destilada dentro dos frascos para amolecer o meio.
Depois de retiradas dos frascos, todo o resto do meio deverá ser retirado das raízes das plântulas.
Esses deverão ficar num local protegido, com umidade constante e deverão ser adubados freqüentemente, com uma solução homeopática de adubo foliar.
Caso tudo corra bem depois de três anos teremos as primeiras plantas floridas.